flag标签,flag标签蛋白多少kd

flag标签,flag标签蛋白多少kd详细介绍

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例如空载对照。如果空载也不行，那基本抗体就歇了。如果有，就要看Flag标签是不是正确表达了，如果表达不正确也会影响到检测的。

质粒进去了。wb就是蛋白质免疫印迹法，flag是编程指令Flag标签抗体的基本应用还包括WB实验，其中在Flag的指令中爆不出来的原因是因为有质粒进去wb里面了，所以就出现了糖基化的反应就爆不出来。

方法一：western　blot　and　strip通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。

看你的flag抗体是否有问题，我是做抗体生产的，原来开发flag抗体时就会对其进行C端、N端、M端的Qc检测，正常情况下三端都需要有识别，我担心你的抗flag抗体有可能不识别N端，还有一种可能就是你的融合蛋白不含flag标签。

这是很正常的，ELISA一般可以检测到ng级的蛋白，而WB的检测限是10微克级的。除非你用ELISA检测到蛋白含量很大，达到了10微克级以上，这时wb做不出来就值得找找原因了。

怎么把flag标签PCR

1、aa sequence of FLAG tag： dykddddk （你可以查商品化质粒带的FLag tag确认一下）。

2、点添加标签在资料卡的最底部我们会看到一个“添加标签”的按钮，点击打开它 ，这时候我们就已经进入添加标签的界面了，我们可以直接使用了。

3、一般用FLAG标签抗体偶联介质或者磁珠进行蛋白的纯化。

4、可以通过基因工程技术手段将所要研究的目的基因和FLAG-tag基因序列连接起来，可以连接在目的蛋白的C端或N端，然后将整合后的基因转入细胞中或胚胎干细胞抑或受精卵中。

5、质粒序列测序。flag标签蛋白检测蛋白过表达是看质粒序列测序是否正确，Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK，编号：133742），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

6、看你的flag抗体是否有问题，我是做抗体生产的，原来开发flag抗体时就会对其进行C端、N端、M端的Qc检测，正常情况下三端都需要有识别，我担心你的抗flag抗体有可能不识别N端，还有一种可能就是你的融合蛋白不含flag标签。

如何设计带flag标签的引物

1、无论您是先提RNA再做反转录，还是直接从DNA中获得基因，考虑到模板的复杂性，都应当使用巢式PCR。建议您先从目的基因的上下游设计一段引物，即外引物，再根据目的基因上下游设计一段内引物。

2、很简单，根据需要，直接把HIS序列添加到正向或者反向引物的5’端，PCR扩增后目的条带就带有HIS标签了。

3、一般是通过设计软件，例如oligo6，primer5等，你可以在网上搜一下引物设计软件下载和使用说明，是比较容易的。我一般用DANMAN设计引物，这个软件操作简单，占用资源也小。

4、正常情况下三端都需要有识别，我担心你的抗flag抗体有可能不识别N端，还有一种可能就是你的融合蛋白不含flag标签。你可以从这两个方面入手解决，至于你运用什么实验设计，我想你应该完全没问题。预祝你能够顺利解决此疑问。

5、可以通过基因工程技术手段将所要研究的目的基因和FLAG-tag基因序列连接起来，可以连接在目的蛋白的C端或N端，然后将整合后的基因转入细胞中或胚胎干细胞抑或受精卵中。

6、lag标签一般不影响细胞定位的，这个蛋白本身的细胞定位是哪里，融合之后还是哪里啊。

如何收集带flag标签的蛋白?

一般用FLAG标签抗体偶联介质或者磁珠进行蛋白的纯化。

融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

可以简化蛋白质的纯化过程、控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、使体内生物事件可视化、提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等。Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽（DYKDDDDK）融合到目标蛋白。

aa sequence of FLAG tag： dykddddk （你可以查商品化质粒带的FLag tag确认一下）。

上面简单介绍了几种常见的蛋白标签，像FLAG-Tag既可以用来检测又可以用来亲和层析纯化，有的像V5-Tag常用来WB/FC检测鉴定。