免疫共沉淀input是什么意思,coip实验原理
免疫共沉淀input是什么意思,coip实验原理详细介绍
本文目录一览： 什么是染色质免疫共沉淀技术（ChIP）？
染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结
ChIP是一种流行的研究转录因子（TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。此技术通过甲醛固定活细胞或组织内的蛋白质-DNA复合物，从而真实地反映细胞内TF与Promoter的结合情况。
一、实验原理
染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法。其基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。然后，通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。最后，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
二、实验流程
1. 细胞准备与固定
2. 超声破碎
3. 抗体孵育与免疫复合物形成
4. 免疫复合物的清洗与富集
5. 解交联与DNA纯化
6. PCR分析或其它分析方法
三、详细步骤
（以第一天至第三天的实验流程为例）
第一天：
1. 细胞的甲醛交联与超声破碎。
2. 除杂及抗体哺育。
第二天：
1. 免疫复合物的沉淀及清洗。
2. 解交联及DNA样品的回收。
第三天：
PCR分析与传统的EMSA技术相比较，ChIP技术能更加真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。ChIP技术和芯片技术的结合，有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。
四、技术应用
ChIP技术主要应用于以下几个方面：
1. 组蛋白修饰研究
2. 转录调控分析
3. 药物开发研究
4. 有丝分裂研究
5. DNA损伤与凋亡分析
五、实验注意事项及优化建议
1. 甲醛交联时间要适当，过长或过短都会影响实验结果。
2. 超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温，防止蛋白变性。
3. 随着技术的发展，如Millipore的MagnaChIP试剂盒等，可以提高ChIP的效率，简化了操作的过程，缩短了实验的时间。为同时进行多个目的蛋白的研究提供了可能。
4. 在研究RNA-蛋白的相互作用时，需要特别注重视RNA的纯化与处理过程，如需使用不含RNase的DNase进行处理等。分析时需使用RT-PCR、芯片杂交等方法对RNA进行鉴定。
六、扩展内容-其他ChIP衍生方法介绍（RIP、ChIP-chip等）
1. RIP：用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合。具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase。最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA。
2. ChIP-chip：用ChIP富集得到的DNA片段去做芯片分析。其步骤包括标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段，和另一个被标记不同探针的对照组样品一起与DNA芯片杂交，再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析。此技术已广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络等方面。
以上是染色质免疫沉淀（ChIP）实验的指南及技术总结，希望对你有所帮助。
coip实验原理
**一、COIP原理及介绍**
COIP（Co-Immunoprecipitation，即免疫共沉淀）技术，是基于抗体与抗原之间的特异性相互作用，而研究蛋白质相互作用的经典方法。这一技术以天然状态下的蛋白复合物为研究对象，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效技术手段。它属于免疫沉淀技术的一种，常被用于鉴定特定蛋白复合物中的未知蛋白组分。
设计理念上，若已知某蛋白是大的蛋白复合物的成员，利用其特异性抗体及与抗体结合的proteinA/G珠，可将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下，达到富集该蛋白复合物的目的。此过程不仅可用来验证已知蛋白与预测蛋白的结合，还可通过质谱分析来鉴定复合物中的其他未知成分。COIP技术的两大特点分别是其天然状态的研究及对蛋白复合物的深入探索。
**二、实验流程详解**
实验的大致流程如下：
1. 细胞裂解：获取总蛋白液。
2. 细胞裂解液与抗体进行孵育，形成蛋白-抗体复合物。
3. 磁珠与蛋白-抗体复合物进行孵育，形成蛋白-抗体-磁珠复合物。
4. 通过洗涤步骤去除非特异结合的蛋白。
5. 洗脱操作，将蛋白-抗体复合物从磁珠上分离出来。
6. 通过WB或质谱进行鉴定。
**三、实验注意事项及建议**
在进行COIP实验时，需注意以下几点：
1. 所使用的抗体必须是IP级别的，购买时需仔细查看抗体的应用范围及使用量。
2. 操作涉及吸取磁珠时，为避免损伤beads，建议使用大口径或经过剪短的枪头。
3. 实验过程中需加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，以确保蛋白的稳定性，避免降解影响结果。
4. 细胞裂解应使用温和的裂解试剂，如NP40或TritonX-100等非离子去垢剂，避免使用高浓度的去垢剂（如0.2%SDS），以免破坏蛋白质间的相互作用。
5. 当无法找到合适的IP级抗体时，可通过表达融合Flag标签的蛋白，利用Flag标签进行免疫沉淀。
**四、具体操作步骤**
1. 使用预冷的PBS洗涤细胞三次，确保最后一次吸干PBS。
2. 在含细胞的1.5mlEP管中加入预冷的IP细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），进行细胞裂解。
3. 离心后取上清液作为Input，并分别取部分上清作为IP样及IgG样本。
4. 在IP样本中加入目的抗体（具体量根据抗体说明而定），IgG样本中加入IgG抗体，进行孵育。
5. 加入IP05（需预先处理），继续孵育。
6. 离心后去除上清，用PBST洗涤磁珠多次。
7. 再次离心后，用Loading buffer处理样品，进行沸水煮处理。
以上即为COIP实验的详细介绍与操作步骤，希望能够帮助您更好地理解和执行该实验。